北京百歐博偉生物技術有限公司擁有Biolog微生物鑒定系統，超低溫冰箱，生物安全柜等儀器設備可進行對微生物分離、

鑒定等常規的分子實驗研究。對我國生命科學研究、生物技術創新和產業發展的需求進行積極的面對社會乃至國外收集保

藏提供微生物菌種資源。在保證生物安全和保護知識產權的前提下，為工農業生產、衛生健康、環境保護、科研教育提供

微生物物種資源、基因資源、信息資源和專業技術服務。 

1. 菌株

Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) ，AHL 高效檢

測菌株，Tc2uM/mL,Spe100,Gm100，28℃

 2. 保存Preinduced cell（簡稱 pre）

2.1 接種KYC55至LB中活化，加入相應抗生素。

2.2 長出后，1%轉接至ATmedium中，28℃培養，長至OD600約0.6左右。

2.3 10000rpm×10min 離心，去除上清。以“AT/甘油＝20”的量加入20％甘油

（即濃縮20倍），分裝至1.5ml離心管中，-20℃保存。

3. 制備待檢測菌上清

3.1 培養待測菌至OD6001.5左右，12000rpm×2min離心保存上清。多余上清或

暫時來不及做assay的上清可以保存在-20℃。

4．Bioassay

 4.1 菌液培養

準備無菌空三角瓶，按每株待檢測菌1.5ml（包括陰性和陽性對照）計算所

需ATmedium的量，加入其中。

加入千分之一KYC55Pre至三角瓶中，和AT混合均勻后，1.5ml每管分裝

到無菌試管中。

標記試管，在每管中分別加入150ul待測上清液。同時用陽性菌株上清和培

養基分別作為陽性和陰性對照。28℃搖床培養過夜。

4.2 bioassay

培養至OD600 0.6左右時，取出進行生物顯影。

在2ml離心管中，分別順序加入：

0.8 ml Z-buffer

 2 滴0.05% SDS

 3 滴氯仿

0.2ml菌液

蓋上蓋子用力振蕩后，再加入100ulONPG。再用力振蕩，并開始計時。

觀察菌液顏色，有明顯變黃后，加入0.6ml1MNa2CO3終止反應，并記錄時

間。若始終沒有變黃，則2h后終止反應。將離心管離心12000rpm×2min，測

OD420。以試管中殘留菌體測OD600。

5. 數據處理：

公式：MillerUnits = 1000*OD420 / [OD600*(Ts-To)*V 菌液

]

其中：Time以min為單位

Volumn 為反應時所加的菌液量（0.2ml）

附：

1. AT 培養基

? 20×ATsalts：(NH4)2SO4 40g；MgSO4 1.56g；FeSO4?7H2O 0.1g；MnSO4?

 H2O

 0.044g；以 dH2O 定容至1000ml；

? 20×ATbuffer：KH2PO4 214g；pH7.3；以dH2O定容至1000mL；

? 50%Glucose

 ? 各組分單獨滅菌，50%Glucose過濾除菌或115℃滅菌。

? 配置AT培養基（1000mL）時，分別將50mL20×ATsalts、50mL20×AT

 buffer、10 mL 50% Glucose 和 890 mL 無菌水在滅過菌的空試劑瓶中混合。

同時加入培養JZA1的抗生素，既免去后期培養的麻煩，也可以防止染菌。

2. Z-buffer

 ? Na2HPO4.7H2O 16.1g；NaH2PO4.H2O 5.5g；KCl 0.75g；MgSO4.7H2O 0.245g；

β-巰基乙醇 2.7ml；

? 保存在4℃。

3. o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranoside（ONPG）（Sigma 公司）

4mg/ml，分裝后-20℃保存，只留一管放4℃使用

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